Jonathan Zaccaï, d’origine belge, commence sa carrière dans la publicité, dont quelques spots sont diffusés en Grande-Bretagne, puis se lance dans le cinéma en 1991 avec Les Enfants de la Révolte. En 2000 il joue dans Petite Chérie d’Anne Villaceque. Le comédien, qui voulait au départ être réalisateur, voit sa carrière décoller en 2004 grâce à son rôle aux côtés d’Agnès Jaoui et Karin Viard dans Le Rôle de sa vie et celui de mort-vivant dans Les Revenants de Robin Campillo. L’année suivante il joue sous la direction de Jacques Audiard dans le thriller De battre mon cœur s’est arrêté et sous la direction d’Anne Fontaine dans Entre ses mains.
En parallèle du cinéma d’auteur, on le voit dans plusieurs blockbusters dont Rémi sans famille (2018), Le Grand Bain (2018), le film américain Robin des Bois (2010) dirigé par Ridley Scott et plus récemment Downton Abbey 2. En 2011, il est récompensé du Magritte du meilleur acteur pour le film Élève libre. Il tourne aussi beaucoup à la télévision, où il est notamment connu pour son rôle dans la série à succès Le Bureau des Légendes.
Jonathan Zaccaï s’est également essayé à la réalisation avec le film satirique JC comme Jésus Christ en 2011 et a publié un roman en 2021, Ma femme écrit.
